电致化学发光分子印迹传感器测定L苯丙氨酸

1引言

L苯丙氨酸(Phe)是人体8种必需氨基酸之一,在多种疾病的诊断治疗和病理学研究上具有重要意义[1-3].目前测定Phe的方法有高效液相色谱法[4]、气相色谱质谱法[5]、电化学法[6]等,但这些方法存在灵敏度不高、选择性不好、仪器昂贵等问题.

电致化学发光法(ECL)因其灵敏度高、仪器简单、检测快速等优点,已被应用于氨基酸的检测[7,8].三联吡啶钌(Ru(bpy)2+3)是目前应用最广泛的发光试剂.由于Ru(bpy)2+3参与化学反应前后的形态和性质基本保持不变,将其固定到电极上反复使用,不仅节约了试剂,有效降低了检测成本,还简化了实验装置[9-11].

分子印迹聚合物(MIP)对目标分子具有良好的特异性识别的能力,已被广泛应用于化学、生物等诸多研究领域.溶胶凝胶法制得的印迹传感器具有物化性质稳定,检测快速且操作简便等优点[12].已有文献报道用该印迹传感器测定血浆样品中的L苯丙氨酸,检出限为1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L[13].

将电致化学发光和分子印迹技术相结合,既可解决电致化学发光法的选择性问题,又可有效提高分子印迹传感器的检测灵敏度[14-16].本研究在Ru(bpy)2+3固相电极上电沉积溶胶凝胶分子印迹膜,制备了一种对Phe的测定兼有高灵敏度和良好选择性优点的传感器.此传感器可应用于尿样中Phe的快速检测.

2实验部分

2.1仪器与试剂

3结果与讨论

3.1ECL电极制备条件的优化

3.1.1ECL电极的电化学和ECL性能碳纳米管由于其优良的电学性能已被应用于Ru(bpy)2+3的固定化研究[17].图1A是Nafion电极(a)和 ECL电极(b)在含有1.0 ×10

Symbolm@@ 5 mol/L Phe的PBS溶液中的循环伏安曲线.曲线b的峰电流明显大于曲线a,说明MWCNTs的引入提高了电极表面的电子传输速率.图1B给出了两种电极的发光强度.ECL电极的发光强度是Nafion电极的9倍,表明MWCNTs能显著提高方法的灵敏度.


本研究采用烷氧基硅烷作为印迹材料.图3为电沉积溶胶凝胶印迹膜的循环伏安图.随着扫描圈数的增加,电极的响应电流降低直至稳定,说明ECL电极表面已完全被印迹膜所覆盖.扫描圈数影响分子印迹膜的厚度.扫描圈数越多,膜越厚,而膜太厚不利于模板分子的洗脱,所以本实验选择扫描圈数为25.

采用扫描电子显微镜观察了不同修饰电极的表面形貌.图4A为ECL电极的SEM图,MWCNTs外径约为20-40 nm,分布均匀,并镶嵌于Nafion膜里及其表面.图4B为ECLMIP电极的SEM图,MWCNTs外径约为35-65 nm,粗略算得印迹膜的厚度为15-25 nm.

3.3模板分子的洗脱

模板分子通过非共价键与功能单体、交联剂结合形成印迹聚合物.这种结合方法的洗脱较温和.试验了热水,无水乙醇,0.01 mol/L NaOH溶液和44% 甲酸洗脱模板分子Phe.结果表明,热水洗脱Phe的过程很缓慢;无水乙醇会溶解分子印迹膜;0.01 mol/L NaOH溶液也会破坏分子印迹膜的完整性,而44%甲酸能快速洗脱模板分子.但由于甲酸浓度太高,易使膜整体脱落.所以本实验选用44% 甲酸和水交替浸泡电极.随着洗脱时间的增加,ECL值逐渐减小,4 h后发光值已接近基线,说明模板分子已洗脱完全.

3.4ECLMIP传感器的电化学性能

图5为不同电极在K3[Fe(CN)6]溶液中的循环伏安曲线.模板分子洗脱前,电极在溶液中几乎不导电(曲线a),说明电极表面被致密的印迹膜所覆盖.随着洗脱过程的进行,K3[Fe(CN)6] 的峰电流逐渐增大,直至不再变化,此时模板分子已洗脱完全(曲线b).对比曲线b和c可知,ECLMIP电极的导电能力不及ECL电极.K3[Fe(CN)6]可自由通过分子印迹膜中的孔穴,但大部分电极仍被不导电的分子印迹膜所覆盖,致使K3[Fe(CN)6] 对ECLMIP电极的电化学响应降低.

[TS(][HT5”SS]图5不同电极在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]中的循环伏安图 (a) ECLPhe MIP电极,(b) ECLMIP电极,(c) ECL电极, 扫速:100 mV/s

Fig.5CVs of different electrodes in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6] (a) ECLLphenylalanine (Phe)MIP electrode; (b) ECLMIP electrode; (c) ECL electrode scan rate: 100 mV/s.[HT5][TS)]

3.5ECLMIP传感器的电致化学发光性能

为了验证传感器是否能对Phe有效响应,测定了Phe的电致化学发光性能.在电位1.02 V时开始出现发光现象,随后发光迅速增大,达到最大值时电位为1.14 V,该电位与图1A曲线b的Ru(bpy)2+3氧化峰电位一致.基于Phe对Ru(bpy)2+3的电致化学发光强度的增强作用,可建立检测Phe的电致化学发光分析法.

3.6测定条件的优化

考察了缓冲溶液的pH值对ECL强度的影响.溶液呈酸性时,ECL值随pH值的递增而不断增大,pH 7.0 时达到最大值.溶液呈碱性时,发光值未明显递减,但空白发光增大,干扰Phe的检测.本实验选择pH 7.0作为最优pH值. 印迹膜中存在着许多孔穴,孔穴的内壁上分布着对模板分子具有特异识别性能的结合位点.实验发现,在10-120 s范围内,ECL值随富集时间的增长而增大;当富集时间大于120 s后,ECL值基本保持不变.表明电极对Phe的吸附已达到平衡,所以选择富集时间为120 s.

3.7线性范围和检出限

3.9传感器的重现性和稳定性

考察了传感器对同一浓度Phe的重现性.将传感器置于待测溶液中富集、扫描后,取出继续洗脱10 min,可使电极恢复原来的响应状态.用同一个传感器平行测定1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液5次,相对标准偏差(RSD)为4.3%;用同样方法制备的3支传感器检测1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液,RSD为4.7%,表明该传感器具有良好的重现性.为了考察其长期稳定性,将新制备的传感器洗脱完全后(4 ℃下保存),每星期测定一次1.0 ×10

Symbolm@@ 9 mol/L的Phe溶液.结果表明,前两周测定的ECL值基本稳定(RSD<5%),但3星期后发光强度出现较为明显减弱.其原因可能与发光物质的溶出有关,传感器的长期稳定性有待进一步改进.

3.10样品测定

References

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