苦参碱对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

[摘 要 ]目的：探讨苦参碱（Matrine,简称Mat）的药理活性,研究苦参碱对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用,为皮肤损伤后出现的增生性瘢痕的治疗提供理论支持及实验依据.方法：将不同浓度梯度Mat作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,测MTT反应的A0值及LDH值,利用通过流式细胞仪检测其细胞周期、DNA相对含量,用免疫组织化学检测Mat用药前后的细胞核内增殖性抗原（proliferatingcell nuclear antigen,PCNA）的表达.结果：增生性瘢痕成纤维细胞在一定范围内呈剂量依赖性增殖抑制,但LDH值无明显改变；DNA相对含量无明显变化,PCNA表达逐渐减弱.结论：Mat 在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖而不引起细胞坏死性改变,但对DNA含量无明显影响.

[关 键 词 ]苦参碱；增生性瘢痕成纤维细胞

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）12-1291-03

组织损伤修复是人体自我保护的一个正常病理过程,而过度修复则会出现组织纤维化,造成增生性瘢痕的出现,从而影响组织、器官的正常功能,导致机体出现异常病变,这种疾病导致的结果是使机体的外形改变以及造成某些功能的丧失和障碍.目前医学工作者将创伤愈合、瘢痕形成的机制及其治疗作为外科研究的重点,花费了大量精力在临床研究上,因此,在这一方面取得了不小的成果[1].苦参类生物碱是以苦参碱为代表,化学结构相似的一类生物碱物质[1].近年来,国内外在研究、使用苦参类生物碱的过程中发现其多方面的药理活性及生物学功能.在目前的研究中,苦参类生物碱是我们多年来使用的增生性瘢痕软化膏的主要活性成分,其临床效果明显,能明显抑制瘢痕的增生,使增生性瘢痕缩小且软化.所以说,苦参类生物碱对于皮肤的损伤修复具有一定的疗效,尤其对增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用非常明显,对于它的作用机制,需要做进一步研究,从而更好的研发出作用疗效较高的治疗药物.为此,我们深入探讨其作用机制,本次试验的对象为体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,通过观察及收据分析,深入研究苦参碱对增生性瘢痕成纤维细胞的细胞周期及DNA含量的影响,从而得出结论.

1.材料和方法

1.1 一般材料：①试验所用药品苦参碱标准品由中国药品、生物制品检定所购买所得,性状为为水溶性粉剂,溶于三蒸水中,浓度为50mg/ml,并且生物碱溶液要经过过滤除菌,最后制成备用溶液储备起来；②DMEM,胰蛋白酶,由美国Gibco公司生产；③胎牛血清（ fatal bovineserum,FBS）：由杭州四季青生物工程材料研究所生产；④DNA染色试剂：由美国COULTER公司生产.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与药物配制：从2012年9月收治的皮肤损伤患者中随机选取8例,这些受试患者年龄为5到33岁之间,平均年龄28岁,其中男性5例,女性3例,患者病程均为1～2.5年,如没有特殊皮肤病经历,不考虑患者的其它疾病.对这些患者进行组织提取,取下的增生性瘢痕组织,放入培养皿中用于细胞的培养.首先,这些培养皿必须进行无菌消毒,然后将取下的组织在培养皿中漂洗,去除组织上的血污及脂肪,确保瘢痕组织绝对干净,表面没有其他组织成分[2].接下来,将洗干净的瘢痕组织用消毒过的剪刀剪碎成约1mm3的小块.制备培养液时,首先将DMEM导入器皿中,然后加入100ml/L胎牛血清、100U/ml的青霉素和100g/L链霉素,苦参碱标准品以1：0.001比例溶解于DMEM培养液中.将块状瘢痕组织培养于制备好的DMEM培养液中,放入CO2 培养箱中培养,将温度调控在37℃.之后等细胞长大,当细胞长成致密单层后,取出培养的细胞,用2.5g/L胰蛋白酶消化,然后以1∶3的方式传代,并将第3～9代细胞用于本次实验.

1.2.2 乳酸脱氢酶（LDH） 的测定取对数生长期的细胞,以105/ml细胞含量接种于24孔培养板培养,加条件培养基分为实验组和对照组,实验组为加500μg的苦参碱溶液,含量为300μg/ml；对照组为加500μl的DMEM 溶液.对这两组溶液继续培养24h,取上清液,用全自动生化分析仪测LDH活性值.

1.2.3 MTT比色法测定细胞增殖状况首先制成细胞悬液,然后将细胞接种于96孔培养板上培养,培养24h后,加入不同质量浓度Mat.同时另外培养两组细胞,将培养的细胞分为两组对照组,一组对照组不加Mat,一组对照组只加培养基,这组为空白对照组.将实验组每组设8个复孔,加入药品等待48h之后加5mg/ml的MTT溶液 20L,继续放置4h,之后离心,去除上层清液,然后加入DMSO200μl,避光振荡10min.之后开始测其细胞增殖情况,采用全自动酶标仪测定各孔吸光度（A0）值,然后参考文献,根据所得数据测其细胞生长抑制率,从而得出增生性瘢痕成纤维细胞的增殖抑制情况.

1.2.4 DNA相对含量测定得到的细胞样品用离心机离心,然后去除上清液.然后进行细胞洗涤,采用PBS洗涤.再加1mlPBS和2ml无水乙醇,然后将细胞冷藏,上流式细胞仪检测.

1.2.5 PCNA检测 取对数生长期细胞于6孔培养板内培养,于CO2培养箱内培养24h后,分2组,分别加入苦参碱培养液和空白培养液；24h后,用甲醇和丙酮固定,晾干24h后,中性树脂粘片,PBS冲洗振荡三次,加入1%过氧化氢,甩干加E抗,4℃放置10h,复温1h,PBS冲洗振荡三次.甩干加I抗,37℃放置1h,PBS冲洗振荡3次,甩干,DAB显色.

2.结果

2.1 LDH测定结果加入苦参碱作用24h后培养上清液中LDH与对照组无显著性差异（P>0.05）,见表1,说明药物含量≤300μg/ml无细胞毒作用.

2.2 Mat对成纤维细胞的细胞毒作用成纤维细胞经Mat处理48h后,经MTT 法检测,活细胞数明显减少,半数抑制浓度IC50值为1.25mg/ml,与对照组相比差异显著,见表2.

2.3 对细胞DNA含量及细胞周期的影响苦参碱对DI影响不明显,各时期细胞分布为G0～G1期细胞略有降低,S期细胞比例明显减少,G2～M期细胞比例明显增多；与对照组相比有显著差异（P<0.01）.见表3.

2.4对PCNA表达的影响将对照组和和苦参碱组的成纤维细胞进行PCNA的测定,测定结果为对照组成纤维细胞的胞核多呈深棕,而苦参碱组的成纤维细胞的胞核呈现多重颜色,且颜色深浅不一,颜色深浅与用药浓度呈负相关关系,随着用药浓度的增加,颜色逐渐变浅.详见图1,2.

3.讨论

多年以来,医学工作者从来都没有停止过对治疗增生性瘢痕的有效方法的探究,尽管现在出现了一些治疗手段,比如传统的治疗方法,包括手术切除,类固醇激素、抗代谢药、免疫抑制剂治疗及放射疗法等等.但这些方法应用于临床之后,患者出现很多不良反应,恢复效果不理想,因此,这些治疗方法并不为人们所热衷,医学工作者通过多年努力,发现中药治疗可以作为治疗增生性瘢痕的有效途径一直在寻找治疗瘢痕的有效途径.故从中药中提取出疗效确切、副作用小的对抗增生性瘢痕的药物具有重要的临床意义[3].从中药苦参中提取的苦参类生物碱是以苦参碱为代表的、化学结构为四环喹嗪啶类稠合体的一类生物碱.医学工作者通过大量的临床试验,证明苦参碱能抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,从而具有治疗瘢痕增生的皮肤性疾病的作用.苦参碱类化合物因为其独特的化学结构,被人们所充分关注,对于成纤维细胞有着重要的药理作用,值得我们进一步探究.

[参考文献]

[1]汤苏阳,蔡宝仁,黄高升.中医药治疗瘢痕的研究进展[J].中国美容医学,2000,9（6）：469.

[2]李晓静,孟刚,宁金龙,等.瘢痕微血管构筑对瘢痕形成发展及临床防治的基础研究[J].现代康复,2001,10（1下）：44-45.

[3]李丹,王平全,张楠森.苦参类生物碱的研究进展及临床应用[J].中草药,1996,27（5）：308.

[收稿日期]2013-04-23 [修回日期]2013-06-03

编辑/张惠娟